繁多的顯微鏡種類你又解多少呢？

暗視野顯微鏡不具備觀察物體內部的細微結構的功能，但可以分辨 0.004μm 以上的微粒的存在和運動。因而常用于觀察活細胞的結構和細胞內微粒的運動等。暗視野顯微鏡的基本原理是丁達爾效應。當一束光線透過黑暗的房間，從垂直于入射光的方向可以觀察到空氣里出現(xiàn)的一條光亮的灰塵"通路"，這種現(xiàn)象即丁達爾效應。暗視野顯微鏡在普通的光學顯微鏡上換裝暗視野聚光鏡后，由于該聚光器內部拋物面結構的遮擋，照射在待檢物體表面的光線不能直接進入物鏡和目鏡，僅散射光能通過，因而視野是黑暗的。操作者通過目鏡觀察到的，是檢物體的衍射光圖像。

暗視野顯微鏡的基本使用方法如下：

1．安裝暗視野聚光器（或用厚實的黑紙片制成遮光板，放在普通顯微鏡的聚光器下方，也能得到暗視野效果）。

2．選用強光源，一般用顯微鏡燈照明，以防止直射光線進入物鏡。

3．在聚光器和玻片之間加一滴香柏油，避免照明光線于聚光鏡上進行全反射，達不到被檢物體，而得不到暗視野照明。

4．進行中心調節(jié)，即水平移動聚光器，使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴格位于一直線上。升降聚光器，將聚光鏡的焦點（圖 2 中圓錐光束的頂點）對準待檢物。

5．選用與聚光器相應的物鏡，調節(jié)焦距，按普通顯微鏡的方法操作。

 

體視顯微鏡又稱實體顯微鏡或解剖鏡，其成像為正立三維的空間影像，并具有立體感強、成像清晰寬闊、長工作距離（通常為 110 mm）以及連續(xù)放大觀看等特點。生物學上常用于解剖過程中的實時觀察。

普通光學顯微鏡的光源為平行光，因而形成的是二維平面影像；而體視顯微鏡采用雙通道光路，雙目鏡筒中的左右兩光束具有一定的夾角體視角（一般為 12o15o），因而能形成三維空間的立體圖像。體視顯微鏡與普通光學顯微鏡的使用方法相近，但更為便捷。二者的主要區(qū)別在于：

1. 體視顯微鏡的鏡檢對象可不必制作成裝片。

2. 體視顯微鏡載物臺直接固定在鏡座上，并配有黑白雙面板或玻璃板，操作者可根據鏡檢的對象和要求加以選擇。

3. 體視顯微鏡的成像是正立的，便于解剖操作。

4. 體視顯微鏡的物鏡僅一只，其放大倍數可通過旋轉調節(jié)螺旋連續(xù)調節(jié)。

 

熒光顯微鏡是利用細胞內物質發(fā)射的熒光強度對其進行定性和定量研究的一種光學工具。細胞內的熒光物質物質有兩類，一類直接經紫外線照射后即可發(fā)熒光，如葉綠素等；另有一些物質本身不具這一性質，但如果以特定的熒光染料或熒光抗體染色，經紫外線照射后亦可發(fā)熒光（附圖 1-4）。

熒光顯微鏡的原理為利用一個高發(fā)光效率的點光源（如超高壓汞燈），經 過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如紫外光3650λ 或紫藍光4200λ)作為激發(fā)光，激發(fā)標本內的熒光物質發(fā)射出各色的熒光后，再通過物鏡后面的阻斷(或壓制)濾光片的過濾，最后經由目鏡的放大作用加以觀察。阻斷濾光片的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進入目鏡以免干擾熒光和損傷眼睛；二是選擇并讓特定的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。

熒光顯微鏡按照光路原理可分為兩種：

1．透射式熒光顯微鏡 較為舊式的熒光顯微鏡，其激發(fā)光源通過聚光鏡穿過標本材料來激發(fā)熒光。其優(yōu)點是低倍鏡時熒光強，而缺點是隨放大倍數增加其熒光減弱。所以它僅適用于觀察較大的標本材料。

2．落射式熒光顯微鏡 激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡

光路中需加上一個雙色束分離器（分色鏡），它與光軸呈 45o 角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進入物鏡，返回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應產物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數愈大熒光愈強。

 

相差顯微鏡是能將光通過物體時產生的相位差（或光程差）轉變?yōu)檎穹ü鈴姸龋┳兓娘@微鏡。主要用于觀察活細胞、不染色的組織切片或缺少反差的染色標本。人眼只能鑒別可見光的波長（顏色）和振幅的變化，不能鑒別相位的變化。而大多數生物標本高度透明，光波通過后振幅基本不變，僅存在相位的變化。相差顯微鏡基本把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。光線透過標本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了 1/4λ（波長），如果再增加或減少 1/4λ，則光程差變?yōu)?1/2λ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減下，提高反差

從結構上看，相差顯微鏡與普通光學顯微鏡不同之處在于：

1．環(huán)形光闌具有環(huán)形開孔的光闌，安裝在光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，聚焦到標本上。

2．相位板相差顯微鏡在物鏡內部增加了涂有氟化鎂的相位板，作用是將直射光或衍射光的相位推遲 1/4λ。相板上有兩個區(qū)域，直射光通過的部分叫"共軛面"，衍射光通過的部分叫"補償面"。相位板按工作效果分為兩種類型：

（1）A+相板：將直射光推遲 1/4λ，兩組光波合軸后光波疊加，振幅加大，標本結構比周圍介質更加明亮，形成亮反差（或稱負反差）。

（2）B+相板：將衍射光推遲 1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，標本結構比周圍介質更加暗淡，形成暗反差（或稱正反差）。帶有相板的物鏡叫相差物鏡，常在物鏡外殼上標以"Ph"字樣。

3．合軸調節(jié)望遠鏡

相差顯微鏡配備有一個合軸調節(jié)望遠鏡（在外殼上標有"CT"符號），用于調節(jié)環(huán)狀光闌的像與相板共軛面完全吻合，以便實現(xiàn)對直射光和衍射光的特殊處理。使用時撥去一側目鏡，插入合軸調節(jié)望遠鏡，調節(jié)合軸調節(jié)望遠鏡的焦點，視野中會呈現(xiàn)兩個圓環(huán)，分別是明亮的環(huán)狀光闌圓環(huán)與較暗的相板上共軛面圓環(huán)。再轉動聚光器上的環(huán)狀光闌的兩個調節(jié)螺旋，使兩環(huán)完全重疊。如明亮的光環(huán)過小或過大，可調節(jié)聚光器的升降旋鈕，使兩環(huán)完全吻合。如果聚光器已升到最高點或降到最低點而仍不能矯正，說明玻片太厚了，應更換。調好后即可取下合軸調節(jié)望遠鏡，換回目鏡。

4．綠色濾光片

用于調整光源的波長。照明光線的波長不同，會引起相位的變化，為了獲得良好的相差效果，相差顯微鏡要求使用波長范圍比較窄的單色光，通常是用綠色濾光片來調整。相差顯微鏡的使用步驟如下：

① 根據待檢標本的性質及要求，挑選適合的相差物鏡。

② 將標本玻片放到載物臺上，進行光軸中心的調整。

③ 使用合軸調節(jié)望遠鏡，調 整環(huán)狀光闌與相板上的共軛面圓環(huán)完全重疊吻合后，換回目鏡。在觀察過程中，每次更換物鏡倍數時，必須重新進行環(huán)狀光闌與相板共軛面圓環(huán)吻合的調整。

④ 加綠色濾光片，按普通光學顯微鏡的操作步驟進行觀察。

 

倒置顯微鏡的結構和普通顯微鏡基本相同，只不過物鏡與照明系統(tǒng)位置交換，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上。主要用于觀察培養(yǎng)的活細胞，需配制相差物鏡。

 

偏光顯微鏡可用于檢測具有雙折射性的物質，如染色體、膠原、纖維絲等。

和普通顯微鏡不同的是：

① 偏光顯微鏡光源前配備偏振鏡（起偏器），使進入顯微鏡的光線為偏振光。

② 鏡筒中有檢偏振鏡（檢偏器，一個偏振方向與起偏器垂直的的起偏器）。

③ 使用旋轉載物臺。當載物臺上放入單折射的物質時，無論如何旋轉載物臺，由于兩個偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線，而放入雙折射性物質時，由于光線通過這類物質時發(fā)生偏轉，因此旋轉載物臺便能檢測到這種物體。

④ 配備補償器或相位片；

⑤ 使用專用無應力物鏡。

 

 

透射電子顯微鏡的組件包括：

1. 電子槍 發(fā)射電子，由陰極、柵極、陽極組成。

2. 聚光透鏡 即電子透鏡，將電子束聚集，可用于控制照明強度和孔徑角。

3. 樣品室 放置待觀察的樣品，并裝有旋轉臺，用以改變試樣的角度，還有裝配加熱、冷卻等設備。

4. 物鏡 為放大率很高的短距透鏡，作用是放大電子像。物鏡是決定透射電子顯微鏡分辨能力和成像質量的關鍵。

5. 中間鏡 為可變倍的弱透鏡，作用是對電子像進行二次放大。通過調節(jié)中間鏡的電流，可選擇物體的像或電子衍射圖來進行放大。

6. 透射鏡 為高倍的強透鏡，用將二次放大后的中間像進一步放大后在熒光屏上成像。

7. 二級真空泵 對樣品室抽真空。

8．照相裝置 用以記錄影像。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，樣品的密度、厚度等都會影響到最后的成像質量，必須制備更薄的超薄切片，通常為 50～100 nm。所以用透射電子顯微鏡觀察時的樣品需要處理得很薄。通常用薄切片法或冷凍蝕刻法制備：

（1）薄切片法 通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式推進樣品切片，切片厚度 20～50 nm，采用重金屬鹽染色，以增大反差。

（2）冷凍蝕刻法 亦稱冰凍斷裂法。將標本置于100？C 的干冰或196？C 的液氮中冰凍后，以冷刀急速斷開標本。斷裂的標本升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面結構，稱為蝕刻。蝕刻完成后，向斷面以 45o 角噴涂一層蒸氣鉑，再以90o 角噴涂一層碳，加強反差和強度。然后用次氯酸鈉溶液消化樣品，剝下碳和鉑的膜，稱為復膜，能顯示標本蝕刻面的形態(tài)。在電鏡下觀察得到的影像即代表標本中細胞斷裂面處的結構。

 

掃描電子顯微鏡于 20 世紀 60 年代問世，目前分辨力可達 6～10 nm。其工作原理是由電子槍發(fā)射的精細聚焦電子束經兩級聚光鏡、偏轉線圈和物鏡射到樣品上，掃描樣品表面并激發(fā)出次級電子，次級電子的產生量與電子束入射角有關，即與樣品的表面結構有關。次級電子經探測體收集后，由閃爍器轉換為光信號，再經光電倍增管和放大器轉變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹姸?，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標本的表面結構。掃描電鏡的標本在檢驗前，需進行固定、脫水處理，再噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。

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