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熒光顯微鏡——如何激發(fā)熒光熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡不同，它不是通過普通光源的照明觀察標(biāo)本，而是利用一定波長的光(通常是紫外光、藍紫光)激發(fā)顯微鏡下標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)，使之發(fā)射熒光，所以，熒光顯微鏡的光源所起的作用不是直接照明，而是作為一種激發(fā)標(biāo)本的內(nèi)熒光物質(zhì)的能源。 我們之所以能觀察標(biāo)本，是由于光源的照明，而是標(biāo)本內(nèi)熒光物質(zhì)吸收激發(fā)的光能后所呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象。本站科研人員利用RD-4C科研級倒置熒光顯微鏡多次實驗得一下知結(jié)論： 1、熒光顯微鏡的特點，熒光顯微鏡主要是它的光源能供給大量特定波長范圍的激發(fā)光，使受檢標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)能獲得必要強度的激發(fā)光。同時，熒光顯微鏡必須具備相應(yīng)的濾光鏡系統(tǒng)。熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的基本工具。它是由超高壓光源、濾片系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)、光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成(圖3-12)，是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。
2、激發(fā)熒光的方式：按光的波長范圍分為UV激發(fā)法(使用紫外線照明法)和BV激發(fā)法(使用藍紫光)兩種。UV激發(fā)法是用短于400nm的近紫外光進行激發(fā)。該法不存在可見的激發(fā)光，所以被觀察的熒光呈現(xiàn)該染料固有的熒光，容易判別標(biāo)本上的特異熒光和背景組織的自身熒光。
3、BV激發(fā)法是以404nm、434nm為中心的由紫外至藍光進行激發(fā)。該方法使用藍光照射標(biāo)本，所以熒光觀察系統(tǒng)的截止濾光片必須使用可完全阻斷藍光并可充分通過所需綠、黃熒光的濾光片。用于熒光抗體法的熒光色素。對于激發(fā)光的極大吸收波長和熒光的極大發(fā)光波長比較接近，所以BV激發(fā)法使用的濾光片必須使用銳截止式濾光片。該法可用藍光作為激發(fā)光，所以熒光色素的吸收效率較高，可得到較明亮的圖像。其缺點是500nm以下的熒光無法看到，而500nm以上的使整個圖像顯黃色。在熒光抗體法中，大多以熒光色素特有的顏色來判斷其特異性，所以在討論微妙的特異性時，上述BV激發(fā)法的缺點往往影響極大。
綜上所述，熒光顯微鏡的照明可根據(jù)聚光器的構(gòu)造和激發(fā)光的波長按以下三點考慮：
①從熒光像的反差要求來看，UV激發(fā)暗場聚光器照明最好。
②以像的亮度來考慮，BV激發(fā)濾光片暗場觀察效率最高。
③UV激發(fā)濾光片暗場觀察和BV激發(fā)暗場聚光器照明的特性，可看作介于這兩種照明方法之間，但前者濾光片暗場的性質(zhì)較強，顯示圖像較明亮，反差??；后者因保留暗場光路的性質(zhì)，故顯示圖像較暗，而反差有所改善。當(dāng)實際使用熒光顯微鏡時，應(yīng)采用最適合標(biāo)本要求的照明法進行觀察。
必須指出，即使像反差最佳的UV激發(fā)暗場聚光器照明，由標(biāo)本折射或散射的部分紫外激發(fā)光也會進入物鏡，這樣在光學(xué)系統(tǒng)中的加拿大膠膠合面和光學(xué)玻璃因激發(fā)引起的自身熒光會使像的反應(yīng)變壞。因此，必須在目鏡前面使用紫外吸收濾光片作為截止濾光片。
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