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什么是微分干涉差顯微鏡?DIC是什么原理?1952年,Nomarski在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)明了微分干涉差顯微鏡。DIC顯微鏡又稱(chēng)Nomarski相差顯微鏡(Nomarki contrast microscope),其優(yōu)點(diǎn)是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比,其標(biāo)本可略厚一點(diǎn),折射率差別更大,故影像的立體感更強(qiáng)。 微分干涉相襯顯微鏡(DIC顯微鏡 differential interference contrast microscope)的物理原理完全不同于相差顯微鏡,技術(shù)設(shè)計(jì)要復(fù)雜得多。DIC利用的是偏振光,透射式DIC顯微鏡有四個(gè)特殊的光學(xué)組件:偏振器(polarizer)、DIC棱鏡、DIC滑行器和檢偏器(analyzer)。偏振器直接裝在聚光系統(tǒng)的前面,使光線(xiàn)發(fā)生線(xiàn)性偏振。在聚光器中則安裝了石英Nomarski棱鏡,即DIC棱鏡,此棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光(x和y),二者成一小夾角。聚光器將兩束光調(diào)整成與顯微鏡光軸平行的方向。最初兩束光相位一致,在穿過(guò)標(biāo)本相鄰的區(qū)域后,由于標(biāo)本的厚度和折射率不同,引起了兩束光發(fā)生了光程差。在物鏡的后焦面處安裝了第二個(gè)Nomarski棱鏡,即DIC滑行器,它把兩束光波合并成一束。這時(shí)兩束光的偏振面(x和y)仍然存在。最后光束穿過(guò)第二個(gè)偏振裝置,即檢偏器。在光束形成目鏡DIC影像之前,檢偏器與偏光器的方向成直角。檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光,從而使二者發(fā)生干涉。x和y波的光程差決定著透光的多少。光程差值為0時(shí),沒(méi)有光穿過(guò)檢偏器;光程差值等于波長(zhǎng)一半時(shí),穿過(guò)的光達(dá)到最大值。于是在灰色的背景上,標(biāo)本結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出亮暗差。為了使影像的反差達(dá)到最佳狀態(tài),可通過(guò)調(diào)節(jié)DIC滑行器的縱行微調(diào)來(lái)改變光程差,光程差可改變影像的亮度。調(diào)節(jié)DIC滑行器可使標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出正或負(fù)的投影形象,通常是一側(cè)亮,而另一側(cè)暗,這便造成了標(biāo)本的人為三維立體感,類(lèi)似大理石上的浮雕,如下圖。
DIC顯微鏡下的硅藻(偽彩色)
DIC顯微鏡使細(xì)胞的結(jié)構(gòu),特別是一些較大的細(xì)胞器,如核、線(xiàn)粒體等,立體感特別強(qiáng),適合于顯微操作。目前像基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進(jìn)行。
落射式的DIC顯微鏡則只需要三個(gè)特殊的光學(xué)組件:偏振器(polarizer)、DIC棱鏡和檢偏器(analyzer),其光學(xué)原理如圖所示:
由圖可知:由光源發(fā)出的光波經(jīng)起偏器后經(jīng)半透半反鏡入射至Nomarski偏振棱鏡,棱鏡將其分成兩束具有微小夾角、振動(dòng)方向相互垂直且振幅相等的線(xiàn)偏振光,通過(guò)筒長(zhǎng)無(wú)限顯微物鏡后,產(chǎn)生剪切量為△x(略小于顯微鏡分辨率)的平行光入射到放置在載物臺(tái)上的被測(cè)表面,從被測(cè)表面反射的兩束正交偏振光各自經(jīng)原路返回,由棱鏡重新復(fù)合共線(xiàn),經(jīng)檢偏器后成像在像面上。由于被剪切的光束產(chǎn)生的分離量略小于顯微鏡的分辯極限,因而在視場(chǎng)中看不到干涉條紋,通過(guò)將被測(cè)樣品的位相變化轉(zhuǎn)化為光強(qiáng)的變化,可看到具有立體感的浮雕成像。
DIC顯微鏡廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域。
微分干涉相襯觀察法 (DIC) 顯微鏡檢查是明場(chǎng)顯微鏡檢查的明智之選,利用這種先進(jìn)的技術(shù)手段可以觀察到未染色的試樣,而這些試樣在明場(chǎng)中成像較弱。
利用偏振光觀察浮雕樣成像
未染色試樣通常并不顯眼,在明場(chǎng)顯微鏡檢查中幾乎看不到試樣的細(xì)節(jié)。但實(shí)際上,這些試樣會(huì)與穿過(guò)它們的光源發(fā)生作用,并產(chǎn)生相移,而這些現(xiàn)象肉眼是看不見(jiàn)的。染色會(huì)導(dǎo)致振幅偏移,且穿過(guò)的光線(xiàn)強(qiáng)度會(huì)存在差異,但絕大多數(shù)情況下,無(wú)生命的試樣才會(huì)發(fā)生上述現(xiàn)象。DIC 顯微鏡檢查是一種利用光程長(zhǎng)度的梯度差和相移,令相位物體在光學(xué)顯微鏡下清晰可見(jiàn)的技術(shù)手段。用戶(hù)可以利用這種方式,通過(guò)適當(dāng)?shù)南嘁r度和分辨率來(lái)觀察活細(xì)胞和有機(jī)體。
DIC 顯微鏡產(chǎn)生的圖像為浮雕狀,看起來(lái)有投影。這些圖像沒(méi)有光暈現(xiàn)象,相對(duì)其他顯微鏡而言,由于具備光學(xué)切片功能,即使較厚的試樣也依然能夠成像。
在 DIC 顯微鏡檢查中,只有偏振光可用于試樣照明。上述偏振光通過(guò)偏光正交平面,被色散成兩條不同的光射線(xiàn)。這兩條光射線(xiàn)彼此非常接近。由于這兩條光射線(xiàn)在試樣中會(huì)發(fā)生折射或散射,因此,會(huì)產(chǎn)生不同的相移。如果這些光射線(xiàn)重新聚合,它們會(huì)互相干涉。光線(xiàn)此時(shí)為橢圓偏光。該偏光將通過(guò)檢偏鏡轉(zhuǎn)變成振幅移位。通過(guò)這種方式,令高達(dá) 1/200 波長(zhǎng)(使用照相機(jī)時(shí),甚至達(dá) 1/1000 波長(zhǎng))之間波長(zhǎng)差的相位移動(dòng),以及整個(gè)波長(zhǎng)都清晰可見(jiàn)。
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